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微量快速特異敏感現場裸眼檢測監測多病原感染的高新技術—— 基于生物惰性載體菌和多病原特異檢測靶標的發現和應用

發布人：朱國強

發布時間： 2022年08月03日

修改時間： 2022年08月04日

關鍵詞：<多病原感染檢測> <生物惰性載體> <靶標抗原>

分類：養殖 > 畜牧獸醫 > 試劑盒 >

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概述：

本技術由全國顛覆性技術：生物惰性載體系統和靶標抗原技術支持，可用于多種動物多病原感染的現場快速檢測和大規模監測，檢測僅需5-20 μL血清樣品，且無需特殊設備和儀器，僅需肉眼在2 min內完成結果判定。與常規血清學檢測方法相比，本技術具有簡易、經濟、即時、特異、敏感等特點，同時可以滿足大批量和現場檢測的要求。目前本技術已授權相關國家發明專利9項，申請國際PCT專利5項均已進入終審。

技術原理：

1. 核心技術（1）生物惰性載體系統生物惰性載體系統是一種可以完全替代硝酸纖維素膜、聚苯乙烯板和聚苯乙烯微球等傳統非生物抗原包被材料的生物材料。生物惰性載體系統由生物惰性載體和惰性延伸載體組成，前者發揮抗原初級放大作用，后者發揮二級和三級放大，因此遠遠顛覆了傳統包被技術無法放大的窘境。生物惰性載體和惰性延伸載體兩者相輔相成，保障了檢測試劑的敏感性。生物惰性載體通過數以千計的生物篩選獲得，通過多次基因工程編輯后與仁和動物血樣均不反應。該技術申報專利前無相關報到，目前已授權國家發明專利4項，并申請國際PCT專利四項。惰性延伸載體的本質是天然的細菌V型分泌系統，是細菌向細胞膜外輸出抗原的展示結構。本技術團隊篩選和開發了三種惰性延伸載體，分別應用于牛羊、家禽和豬病原感染抗體的早期篩查的間接凝集試劑的研發。目前已授權1項基于惰性延伸載體的發明專利，正在申請國際PCT專利1項。（2）靶標抗原技術本單位提出的靶標抗原技術是一種結合電腦生物學、結構生物學、分子生物學和生物信息學等交叉學科融合而成的新技術。靶標抗原顛覆了傳統完整蛋白質抗原分子量大、表面電荷復雜、交叉反應強、不穩定易降解等缺陷，并依托于生物惰性載體技術，實現了血清學檢測抗原的第四級放大。做一個形象的比喻，將生物惰性載體比作大樹粗壯的樹干，惰性延伸載體好比樹干上延伸的樹枝，而靶標抗原便是樹枝的進一步放大延伸，即位于大樹末端的樹梢。靶標抗原具有專一性，能分別結合針對病原的感染性抗體（好比樹梢上的鳥），這個反應過程通過間接凝集技術展示，最終形成肉眼可見的凝集顆粒（靶標抗原-抗體復合物聚合體）。目前，本團隊基于靶標抗原技術已取得4項發明專利授權，并已研發出針對牛羊、家禽和豬病原靶標抗原用于檢測結果的相互驗證，并基于相關參數優化和推出相關凝集檢測監測產品3種。關于牛羊、家禽和豬病原靶標抗原檢測產品的2項發明專利申請正在申請。 2. 配套技術（1）基于生物信息學和結構生物學的靶標抗原篩選技術由于病原感染機制十分復雜，找到合適的靶標抗原是決定檢測敏感性和特異性的根本保障?；谏镄畔W和結構生物學的靶標抗原篩選技術能夠通過計算機模擬和選定免疫原性好的靶標抗原，從而加快病原感染抗體檢測相關試劑的研發。（2）基于生物惰性載體和靶標抗原的間接凝集試劑制備技術基于生物惰性載體和靶標抗原的間接凝集試劑制備技術是研發檢測試劑平臺的關鍵技術。利用該技術可以實現檢測試劑的快速制備，檢測效果的快速驗證，和大規模批量生產。

創新點：

1. 泛性型生物惰性載體的發現和應用。泛性型生物惰性載體是本技術至關重要的研究平臺，與此前的惰性載體為乳膠顆粒、納米金屬等非生物材料完全不同的功能，本研究中發現和探索的生物性惰性載體乃是世界首創的、“活性”惰性載體。由于該生物惰性載體與任何年齡的人、任何品種的動物血清、血漿和全血均不發生非特異性反應，故稱為泛性型生物惰性載體?；谠撗芯科脚_相關的研究內容已獲得認可，目前在該方向已申請國家發明專利6項，授權5項，1項已通過實質性審查；同時申請國際PCT專利5項。 2. 首次建立基于生物惰性載體的抗原展呈系統?？乖钩适侵缚乖跃哂泄δ芎突钚缘男问秸钩时磉_并暴露在生物載體表面，然而如果載體是非生物材料，則只能將有限抗原包被在表面，考慮包被抗原為異源表達、純化的蛋白質，與功能性天然抗原的構象不一致。而本研究建立的基于生物惰性載體的抗原展呈系統則是以生物惰性載體為基礎，展呈的是功能性天然的抗原構象，且調控抗原大量表達，從而大大提高檢測的敏感性和靶向抗原的特異性。 3. 首次建立基于靶靶標抗原的檢測方法。靶標抗原是病原建立感染過程中首要發揮免疫應答作用的大分子黏附素、抗原表位和其特異性受體結合域。本研究組合多表位融合抗原技術平臺、V型分泌系統和其載客結構域功能，將基于泛性型惰性載體菌表面展呈表達靶向抗原抗體組合的新穎間接凝集試驗率先應用于現場診斷。 4. 首次提出具有多系統對照的檢測技術。目前的血清學檢測方法沒有樣品本身對照，以ELISA：ELISA判定結果是以系統“cut off值”為標準，高于“cut off值”為陽性，而低于“cut off值”為陰性。其后果是無法排除個體差異造成的干擾，導致假陽性變多；并且使得一些位于“cut off值”附近的結果重復性差，判定變得模棱兩可。缺乏樣品本身的系統對照是傳統血清學檢測方法的共性問題，所謂樣品本身對照是指某一份樣品檢測應該具備能夠建立結果判定的對照系統。本研究建立了多樣品本身對照的檢測方案：系統樣品對照1是生物多性載體系統，可以反映載體系統的惰性能力和檢測樣品是否變質變性，數據是否可信；系統樣品對照2是缺乏靶標抗原檢測系統的靶標抗原，該對照與檢測系統僅相差靶標抗原。因此，如果檢測某一份樣品時，系統對照1和系統對照2均為陰性，而靶點抗原檢測系統為陽性則可判定為陽性；如果系統對照1和系統對照2均為陰性，而靶點抗原檢測系統為陰性則可判定為陰性。具有多樣品本身對照的檢測方法結果判斷快，沒有主觀性帶來的干擾。 5. 實現多靶標、多病原感染的檢測和監測。目前沒有任何一種血清學檢測技術能夠做到多靶標、多病原感染的檢測和監測，這是因為如果想要進行多靶標、多病原感染的檢測就需要表達、純化各類抗原，這是一項及其耗費人力物力的工作，其次是多種抗原無法進行同時包被和應用，只能分別包被和檢測，因為同時包被會增加難以避免的非特異性反應，換句話說，目前所謂的多病原檢測方法均為多種試劑盒組合而成的多重檢測。但是本研究開發出的多靶標、多病原感染的檢測和監測與之不同，用于檢測不同病原的靶點抗原在本系統平臺上不會導致非特異性反應的出現，這些靶標抗原相互之間沒有互相作用影響，且具有各自的生物活性和功能。因此，對于同一份待檢樣品在檢測監測體系只需要加一次樣就可以得知是否有多病原感染的可能性，然后通過特定病原體的靶標抗原加以分別驗證即可確診。

主要技術指標：

本技術通過與正在且一直應用的血清學技術從敏感性、特異性、重復穩定性進行了對比，均優先正在應用的血清學檢測方法。值得注意的是，從檢測效率和便捷性方面考慮，本方法僅需5-20 μL（約1滴血）和2 min的檢測時間已在上述方法中一騎絕塵。成本控制大大縮減。綜上所述，本檢測技術平臺有望實現對現有技術的革新替代。

節本增效情況：

1. 牛羊布魯氏菌病和結核?。ā皟刹　保z測技術應用和推廣情況（1）中國動物疾控中心布病研究室（董浩博士，主任），測試驗證牛、羊布病樣品多批，鑒于虎紅平板凝集試驗在羊上使用的局限性，每批大于30份樣品測試驗證山羊和綿羊布病樣品多批，每批大于30份樣品?；菊页鲈谘蛏鲜褂玫木窒扌砸蛩?。（2）中國獸藥監察所，國家動物布病參考實驗室，OIE動物布病參考實驗室（丁家波博士，主任），已測試驗證牛布病樣品多批，并作比較驗證和陰性結果的排查分析。（3）中國動物衛生與流行病學中心（山東青島）動物布病研究室（邵衛星博士，主任）測試驗證牛布病樣品多批，貴單位聯合虎紅平板凝集試驗、試管凝集試驗和偏振光試驗的一致結果與我們方法結果的一致性，再次驗證我們方法的快速敏感特異性優勢。（4）中國獸藥監察所，科技部十三五重點研發項目動物布病研究首席科學家（毛開榮研究員，主任）測試驗證牛布病樣品，得到他本人的滿意肯定。（5）全國多地區送檢樣品多批測試和驗證，包括江蘇徐州，河北，廣西、貴州等地比較檢測WHO陽性血清(已5倍稀釋的工作濃度)還能繼續稀釋32倍（1：32），能檢出，敏感性非常高；檢測中監所陽性血清（陽11#）工作濃度，還能繼續稀釋至1:4，可檢出；檢測臨床牛血清（300268 睢寧）至少稀釋至1:4，可檢出；比較檢出不同動物布病抗體,我們發現該方法結果反映出牛和羊樣品有一定的差異性，需要優化羊樣品測試條件，我們也找到羊樣品測試優化條件。 2. 豬重要病原感染檢測技術應用和推廣情況（1）2021年8月，揚州大學測試中心利用競爭ELISA檢測了80份豬血清樣品的非洲豬瘟病毒（ASFV）感染抗體，隨后用本方法加以驗證，結果發現3份接近但未達到Cut off值的檢測樣品利用本方法可檢測出陽性，證明本方法的敏感性高于ELISA。（2）2021年11月，檢測江蘇農業科學院獸醫所在哈爾濱獸醫研究所人工感染ASFV獲得的20份豬血清血清，經過本技術兩種不同靶標抗原檢測，均能檢測出ASFV感染性抗體。（3）在2021年10月-2022年3月，揚州大學測試中心提供了來自江蘇、浙江、安徽和山東等地的豬血清樣品，這些樣品均經過熒光定量PCR檢測。結果表明，本方法能夠檢測出所有熒光定量為陽性的結果，并且發現部分熒光定量為陰性的結果利用本方法也檢測為陽性，該結果表明核酸檢測局限在血液中出現病毒血癥后，因此核酸檢測不利于ASFV早期防控。（4）上海市農業科學院，李本強研究院提供的豬流行性腹瀉病毒（PEDV）感染陽性豬血清和SPF豬血清，江蘇省農業科學院獸醫所提供的傳染性胃腸炎病毒（TGEV）血清和PEDV血清，經本方法驗證100%符合。 3. 家禽種源性疾病感染檢測技術的應用和推廣（1）北京中農榜樣蛋雞育種有限責任公司提供了10份雞白痢沙門氏菌商品化凝集抗原檢測陽性的雞血清，經本技術檢測，證明這些血清感染背景復雜，不僅包括雞白痢沙門氏菌感染，還存在腸炎、鼠傷寒沙門氏菌感染，以及混合感染。該結果證實目前商品化凝集抗原存在交叉反應和敏感性不佳的局限性。（2）深圳市綠詩源生物技術有限公司、云南大學動物醫學院和安徽榮達生物技術有限公司對本課題組研發的雞白痢、腸炎沙門氏菌感染抗體檢測試劑進行了第三方驗證，以商品化凝集抗原作為標準，符合率為85%左右，以細菌分離鑒定為標準，符合率為100%。該結果說明了本方法的特異性遠遠高于正在應用的商品化凝集抗原。（3）安徽榮達生物技術有限公司和江蘇省家禽科學研究所國家基因庫利用本技術試劑在祖代雞實施雞白痢沙門氏菌和禽白血病病毒兩種種源性疾病的檢測和凈化驗證。通過淘汰陽性父母代雞，成功在子一代（F1代）實現了“兩百的凈化”。（4）華南農業大學和廣東溫氏家禽有限公司目前正在將本課題組研發的雞白痢沙門氏菌和禽白血病病毒感染檢測試劑進行推廣，目前正在對推廣反饋的意見進行匯總和改進。

市場應用前景：

團隊旨在建立一種在敏感性、特異性、檢測便捷性、檢測效率、成本等方面突破目前正在應用的血清學檢測方法的技術瓶頸。這種技術可以應用于人和動物各類多種疾?。òǜ腥拘约膊?、病原感染相關腫瘤性疾病等）的檢測和監測，也可以在人醫學體檢中實施精準監測、診斷，且檢測成本大大降低，具有廣泛的商業應用前景！

適宜條件（領域、區域）：

1. 牛、羊養殖單位和檢疫工作單位奶?！皟刹　笔侵改膛＝Y核病和奶牛布魯氏菌病，為二類動物疫病，都是人畜共患傳染病。隨著全國大市場、大流通的進一步形成，奶牛交易頻繁，奶?！皟刹　钡陌l生呈上升趨勢。據報道，我國是全球結核病最嚴重的國家之一，人的結核病13%來自牛的結核分枝桿菌感染，人牛結核病的交叉感染是造成我國結核病流行的原因之一；布病也有上升趨勢，在2021年的一項調查中，全國11個?。ㄗ灾螀^）采集的10231份牛血清樣品布魯菌病陽性率達46.52%，某地一牛場60%的牛檢出布病陽性，10個獸醫、配種員中就有9人感染布病。因此，對于奶牛場“兩病”的日常監測絲毫不能松懈。本技術產品可實現快速、準確監測牛羊“兩病”。 2. 養豬場自2018年我國報道首例非洲豬瘟病例開始，我國養豬業承受了巨大的損失，但截止目前沒有標準化的防控手段和策略。本技術團隊研發的非洲豬瘟感染檢測試劑的敏感性好，檢出時間能早于核酸檢測方法，在養殖棟舍的早期精準“拔牙”能夠發揮關鍵作用。 3. 家禽養殖單位、家禽基因保種單位和家禽疫病凈化示范場建設單位目前傳統家禽疫病凈化采用連續穿帶，代代監測的方略，這種方案耗時長、投入大。而利用本團隊的研發產品清除陽性父母家禽，便能夠實現在子一代（F1代）疫病的凈化。

其他：

預期目標
1. 技術和產品推廣
技術團隊負責人為江蘇省奶牛產業技術體系疾病防控創新團隊崗位專家。目前本技術依托體系現建有江蘇省示范推廣基地7個，輻射和服務規?；膛?0余個，并在2023年實現江蘇省的主要奶牛養殖基地的技術覆蓋。
目前本團隊已與揚州的多家養豬單位進行合作，對技術研發和產品試點應用起到了關鍵作用，預期在2023年實現技術和產品在全省的宣傳和拓展應用。
家禽凈化產品目前在江蘇、浙江、廣東、廣西的多家單位開始推廣應用，預計在2023年實現全國的大規模推廣應用。
2. 預計在2023年完成產品報批準備工作
結合目前的產品驗證情況、使用情況，相關推薦單位對產品的應用價值十分認可，必要專利在2022年底可獲得授權，同時考慮到疫情影響，預計在2023年能夠完成產品的報批工作。

成果成熟度：可以量產
成熟度說明：目前本成果團隊已具備量產的能力。知識產權情況： ZL201811422515.5, 國家發明專利，整合四拷貝F18菌毛操縱子基因和雙拷貝F4菌毛操縱子基因的益生菌克隆株、構建方法； ZL201811422062.6, 國家發明專利，整合四拷貝功能性F18菌毛操縱子基因的益生菌克隆株、構建方法； ZL201811421935.1, 國家發明專利，整合單拷貝功能性F4菌毛操縱子基因的益生菌克隆株、構建方法及應用； ZL201910424381.9, 國家發明專利，一種惰性載體大腸桿菌及其潛在應用； ZL201910424369.8, 國家發明專利，一種惰性載體沙門氏菌及其潛在應用； ZL202010400163.4, 國家發明專利，惰性載體間接凝集試驗檢測系統及其應用； ZL202010428277.X, 國家發明專利，一種泛性型惰性載體大腸桿菌及其潛在應用； ZL202010427735.8, 國家發明專利，一種泛性型惰性載體沙門氏菌及其潛在應用； ZL202011289887.2，國家發明專利，一種表達SEF14功能性菌毛的重組菌及其應用。獲獎情況： 2021年度全國顛覆性技術創新大賽優秀項目
轉化條件及成果應用事項：前期已做了很好的積累，我們具備商品化研發實力，期待很快商品化和行業應用。
預期交易方式：許可轉讓

金額：	元
備注：